Système de micro-injecteur à base microfluidique pour la perfusion de médicaments et l’électrophysiologie combinées

Résumé

Source : Vanegas, M. I., et al. Système de micro-injecteur pour la perfusion combinée de médicaments et l’électrophysiologie. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo fait la démonstration d’un dispositif microfluidique à base de microélectrodes qui délivre une solution médicamenteuse à travers un tube capillaire, à l’aide d’une solution de marqueur à base d’huile pour un suivi précis du volume et permettant un enregistrement neuronal et une perfusion de médicament simultanés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Construction du micro-injecteur pour la stimulation et l’enregistrement (Figure 1a)

1. Mesurez la longueur de la canule et de la sonde (dans cet exemple, un nanocapteur). La sonde doit être plus longue que la canule de la longueur qu’elle doit dépasser de l’extrémité de la canule (selon la conception de la sonde), plus environ 2 cm.
2. Sous une loupe ou un microscope (grossissement ~10x), chargez la sonde dans la canule ; si possible, une rétrocharge est préférable pour protéger l’extrémité de la sonde.
   REMARQUE : Cette étape, effectuée manuellement, est un défi. Il est recommandé de s’entraîner avec une microélectrode sous une loupe avant d’essayer avec une sonde expérimentale réelle.
3. Passez la canule (contenant la sonde) à travers la virole supérieure, la jonction en T et la virole inférieure.
   1. Si la sonde n’est qu’un seul fil sans aucune attache, chargez-la dans la canule et insérez l’ensemble dans la jonction en T à partir de la virole inférieure. Le haut de la canule (côté plat) doit être positionné au milieu de la jonction en T, à l’intérieur de la virole inférieure mais pas de la virole supérieure. La sonde expérimentale ou le biocapteur doit dépasser du haut de la virole.
      REMARQUE : Des embouts sur mesure peuvent également être fabriqués en perçant un trou dans les bouchons de la virole à l’aide de micro-forets, la taille du trou étant basée sur le diamètre nécessaire pour serrer la canule à la jonction en T.
4. À l’aide de la clé à virole, serrez les embouts en haut et en bas de la jonction en T. Ne serrez pas trop. Un petit morceau de tube peut être ajouté pour renforcer le support d’électrode à l’intérieur de la virole supérieure.
5. Soudez des broches en or à chacune des bornes de la sonde (signal, masse, etc.), selon les spécifications de la sonde.
6. Ajustez la position relative de la sonde et de la canule. Mesurez la distance à laquelle la sonde dépasse de la canule sous grossissement et ajustez manuellement à partir de l’extrémité supérieure (la sonde peut glisser librement dans les embouts).
7. Ajoutez de la colle époxy entre les broches dorées et la virole supérieure pour fixer la sonde à la virole.
8. Dévissez la virole supérieure pour rétracter la sonde à l’intérieur de la canule. Vérifiez visuellement que la sonde est entièrement à l’intérieur de la canule sous grossissement.
9. Fixez l’injectrode au micromoteur.

2. Construction du micro-injecteur pour perfusion de médicament (Figure 1b)

1. Fixez l’extrémité « non biseautée » ou plate de la canule au bas de la jonction en T à l’aide d’une virole. Utilisez la clé à virole pour serrer la virole.
2. Fixez un petit morceau de tube capillaire (~1,5 cm) au sommet de la jonction en T en le passant à travers la virole standard. Serrez à l’aide d’une clé à virole.
3. Chargez la microélectrode à travers le tube capillaire, la jonction en T, la canule et les embouts correspondants.
4. Assurez-vous que l’extrémité arrière de l’électrode dépasse de moins de 1 cm de l’arrière du tube capillaire et que l’extrémité de l’électrode dépasse de la canule à la distance souhaitée sur la face inférieure. La position de l’électrode peut être réglée manuellement à partir de l’extrémité supérieure.
5. Soudez une broche en or à la borne de la microélectrode.
6. Ajoutez de la colle époxy entre la goupille dorée et la virole supérieure pour fixer la microélectrode à la virole.
7. Dévissez la virole supérieure pour rétracter la sonde à l’intérieur de la canule. Confirmez visuellement que la microélectrode est complètement rétractée dans la canule.

3. Construction du circuit microfluidique (Figure 2)

1. Placez une planche à pain sur une surface stable. Placez les deux vannes à trois voies parallèlement aux côtés les plus longs de la planche à pain, environ 6 po. séparés, avec un port (celui qui est toujours ouvert) se faisant face. Utilisez des vis pour fixer les vannes à la planche d’essai.
2. Placez une règle à côté des valves (pour mesurer et suivre le mouvement des fluides à l’intérieur de la tubulure capillaire).
3. Chargez un mélange d’huile à faible viscosité 1:1 et de colorant alimentaire (marqueur) dans la seringue étanche au gaz et placez-le dans la pompe du marqueur. Coupez un morceau de tube capillaire et utilisez des embouts standard et des connecteurs Luer-lock pour connecter la seringue à l’un des orifices de la valve d’entrée. C’est la « ligne de repère ».
4. Découpez un court morceau de tube capillaire pour la « ligne de règle ». Utilisez des embouts standard pour serrer les orifices opposés des vannes.
5. Coupez deux morceaux plus longs de tube capillaire pour connecter la valve de sortie à la micro-injecturette, et pour connecter la pompe à médicament à la vanne d’entrée (utilisez des embouts standard).
   REMARQUE : La longueur de ces deux conduites dépend de la configuration expérimentale, l’une doit être suffisamment longue pour aller de l’appareil de perfusion à l’animal, et l’autre de la pompe à médicament à la vanne d’entrée. Utilisez une pierre de clivage pour couper le tube capillaire.

4. Montage du micro-injecteur sur le micro-variateur (Figure 3)

1. Assurez-vous que la microélectrode/sonde expérimentale est rétractée dans la canule avant de le monter.
   REMARQUE : Le tube de guidage doit être en position dans le micro-entraînement.
2. Fixez un adaptateur sur mesure au micro-injecteur.
3. Chargez le micro-injecteur par le haut à travers le tube de guidage et fixez-le à l’adaptateur à l’aide de vis.
4. Mesurez la position du micro-entraînement (profondeur) à laquelle le micro-injecteur dépasse du tube de guidage, puis rétractez-le de ~1 cm pour préparer l’insertion.
5. Pour les expériences de micro-perfusion, connectez la « ligne cérébrale » à l’ouverture de jonction T inutilisée de la microélectrode. Utilisez une virole standard et serrez-la à l’aide d’une clé à virole.

5. Rinçage et préparation du système microfluidique

1. Positionnez le microentraînement avec le micro-injecteur sur un bécher à déchets.
2. Chargez la chlorhexidine (p. ex. le nolvasan, dissous à 20 g/L) dans la seringue étanche au gaz de 1 mL et placez-la dans la pompe à médicament. Tournez le sens d’écoulement des valves de sorte que le fluide passe de la pompe à médicament à travers la valve jusqu’à la ligne de valve et sort de la « ligne cérébrale ».
3. Rincez le circuit avec de la chlorhexidine à l’aide d’un faible débit (50-200 μL/min) pendant au moins 10 min. Répétez les étapes 5.2 à 5.3 avec une solution saline stérile, puis de l’air.
   REMARQUE : Il est important de vérifier s’il y a des fuites à ce stade. Appliquez doucement des lingettes non pelucheuses aux jonctions pour aider à révéler toute fuite de liquide à travers les viroles.
4. Chargez le médicament dans la seringue étanche au gaz de 500 μL, comprimez l’air, puis placez-le dans la pompe à médicament. Débit à 50 μL/min jusqu’à ce que quelques gouttes s’écoulent du micro-injecteur.
5. Faire tremper le tube guide dans de la chlorhexidine (dissoute à 20 g/L) pendant 15 min.
6. Tournez la direction de la vanne de sortie vers la « ligne de rinçage ». Avancez la pompe du marqueur jusqu’à ce qu’un bord clair de couleur et d’huile soit observé sur la ligne de la règle. Assurez-vous qu’il y a toujours de l’huile entre le médicament et la couleur afin de ne pas mélanger les deux matériaux solubles dans l’eau et de perdre le bord tranchant entre eux. Marquez la position de départ de cette ligne d’huile/colorant (avec un morceau de ruban adhésif ou un marqueur).
7. Tournez la direction de la valve de sortie vers la ligne du cerveau.

6. Réalisation d’un enregistrement ou d’une expérience de perfusion

REMARQUE : Les étapes de manipulation des animaux varient selon le laboratoire et l’expérience. Les étapes suivantes doivent être effectuées après la mise en place chirurgicale et la préparation nécessaires à l’exposition de la dure-mère. Après l’expérience, toutes les étapes post-procédure nécessaires doivent être effectuées conformément aux protocoles approuvés par l’établissement.

1. Fixez le microdisque à la chambre d’enregistrement. Abaissez le tube de guidage pour pénétrer dans la dure-mère. /<>REMARQUE : Le tube de guidage ne doit pas pénétrer plus loin que la dure-mère afin d’éviter d’endommager le cortex.
2. Abaissez le micro-injecteur à environ 2 mm au-dessus du site d’enregistrement/d’injection dans le cerveau.
3. Serrez la virole supérieure (microélectrode/biocapteur saillant) et connectez les broches dorées au système d’enregistrement. Continuez à avancer le micro-injecteur vers le site cible.
   REMARQUE : N’oubliez pas d’inclure la distance à laquelle la microélectrode s’étend au-delà de la canule dans les calculs.
4. Pour les expériences de perfusion, utilisez la micro-pompe manuelle pour déplacer la colonne d’huile de 1 cm toutes les 3 min (~60 nL/min). Une fois que le volume désiré a été infusé, basculez la vanne de sortie vers la conduite de rinçage.
   REMARQUE : Le volume infusé variera en fonction de l’espèce du modèle et de la zone cérébrale ciblée. Des débits plus rapides peuvent endommager le tissu neural.
5. Lorsque les expériences sont terminées, rétractez le micro-injecteur à l’intérieur du tube de guidage (laissez la sonde en saillie). Retirez ensuite le microdisque pour le rinçage. Rincez le système microfluidique pour le préparer à la réutilisation. note: D’après notre expérience, le micro-injectrode durera plusieurs utilisations si des soins appropriés sont pris. La qualité de l’enregistrement électrophysiologique diminue plus rapidement que la capacité d’injection.

Résultats

Figure 1 : Fabrication étape par étape du micro-injectrode. (a) Configuration pour une utilisation indépendante du système microfluidique. La canule et la sonde sont mesurées afin de confirmer que l’extrémité de la ...

Matériaux

https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 Clé à virole Clé hexagonale LabSmith 1/8 » pour l’installation de raccords et de bouchons monoblocs (clé hexagonale LS-HEX 1/8 ») https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.htmlChlorure de sodium https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rshttps://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vannes manuelles	3 ports Vanne de sélection manuelle à 3 ports LabSmith (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Canules	Vita Needle Company	304 Tube en acier inoxydable, Diamètre extérieur 228μm, Diamètre intérieur 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf Pierre de
clivage	Molex	Pierre de clivage 1 » x 1 » (réf. 1068680064)	Il est fortement recommandé de suivre la méthode de clivage des tubes capillaires :
https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf Diacétate de clorhexidine	Walmart	Nolvasan solution désinfectante (AAP311)	Utilisé pour le rinçage du circuit microfluidique, dissous à 20 g/L
Adaptateur personnalisé	Fournisseur	personnalisé-Adaptateur	usiné sur mesure pour connecter le micro-injecteur au micro-entraînement hydraulique
Pilote		Tournevis LabSmith T7 TORX pour l’installation de vis pour plaque d’essai (pilote LS-TORX)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Colle époxy	LabSmith	Adhésif époxy haute résistance en deux parties (LS-EPOXY) pour le collage du métal et du plastique	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Virole	Raccord monobloc LabSmith	(C360-100) pour le raccordement d’un capillaire, trou traversant dimensionné pour un capillaire	de 360μm ODhttps://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
Bouchon à virole	LabSmith	(C360-101) pour une utilisation dans n’importe quel port -C360
Seringue étanche au gaz	Hamilton Company	500μL Seringue étanche au gaz modèle 1750 (81220) et seringue étanche au gaz 1mL modèle 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
Broches dorées	Aim-Cambridge	Mâle plaqué or Connecteur à sertir (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
Lingettes non pelucheuses	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes Delicate Task	Lingettes non pelucheuses, utilisées pour identifier les fuites dans le système
Colorant	alimentaire liquideMcCormick & Co.	À base d’eau, colorant alimentaire liquide noir (52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
Huile à faible viscosité	Clearco Products Co.	Fluide de silicone pur Octaméthyltrisiloxane avec une viscosité de 1cSt à 25°C (PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
connecteur Luer-Lock	Adaptateur Luer-Lock LabSmith (C360-300), raccord femelle pour connecter la seringue Luer Lock à un tube capillaire de 360μm		https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Micro-forets	Grainger	Micro foret, 0,23 mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Microélectrode	FHC	Microélectrode métallique, tungstène avec isolation	époxyhttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Micromanipulateur hydraulique à huile	Narishige Group	Micromanipulateur hydraulique à huile avec tube de guidage attaché (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Tube capillaire Polymicro	Molex	Polymicro Tube capillaire en silice fondue flexible (TSP150375), diamètre extérieur 375μm, diamètre intérieur 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
Pompe à seringue programmable	Harvard Apparatus	Standard Infuse/Pull Pump, programmable (70-2213)
Ruler	Empire	Règle rigide en acier inoxydable 6 » (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
Jeu de vis	LabSmith	Jeu de vis de montage de soupape (LS-SCREWS .25), vis fileteuses (2-28 x 1/4 ») pour monter les vannes sur la planche	à painhttps://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Plate-forme Standard Breadboard	LabSmith	4 » x 6 » (LS600), avec espacement des trous de 0,25 » pour le montage du circuit	de fluidehttps://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
Solution saline stérile (chlorure de sodium) 0,9 %.	Baxter	0,9 % stérile	Stérile pour perfusion intraveineuse
Filtres stériles pour seringues	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ Filtres stériles pour seringues avec membrane PES (SLGPM33RS)
Stoelting Pompe à microseringue manuelle Stoelting	Company	Pompe manuelle de perfusion/retrait (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-junction	LabSmith	Té d’interconnexion (C360-203) pour combiner des flux d’écoulement, à utiliser avec des tubes capillaires de 360μm OD

à Bouchon monobloc